После создания Сергиевского историко-художественного музея он в 1926г. был переведен на штатную должность — старшего помощника хранителя музея. Лаврская Комиссия и сменивший ее в 1925г. музей (в том числе деятельность их сотрудников по реставрации икон и изданию каталогов-описаний коллекций) спасли бесценные памятники Троице-Сергиевой Лавры — выдающегося религиозного центра России. С 1927г. Ю.А.Олсуфьев — член Правления музея. Организовал две выдающиеся выставки, посвященные древним книгам и иконам. Являлся заведующим отдела "Эмали, скань, чернь, финифть, резьба по дереву, металлу и кости".
Внес вклад в научную реставрацию Троицкого собора, икон и фресок. Вел научные наблюдения за расчисткой ряда выдающихся икон, в том числе "Троицы" Андрея Рублева. Ю.А.Олсуфьевым было написано и с огромным трудом опубликовано более 20 работ с описанием художественных коллекций Лавры. Ни один музей страны не имел в 1920-е годы столь подробных каталогов в области религиозного искусства. Он занимался в Лавре иконами, миниатюрами древних книг, серебром, шитьем. Весной 1928г., после издания книги Ю.А.Олсуфьева и П.А.Флоренского "Амвросий, Троицкий резчик XV века" началась травля сотрудником музея. 16 июня 1928г. Ю.А.Олсуфьев обратился с письмом к Е.П.Пешковой, указывая:
    "В N 3 журнала "Безбожник" и в N 85 "Комсомольской Правды" были помещены:
     компрометирующие меня, как советского служащего, сведения, что я, будто бы,
     "пристроился" в Сергиевском музее,... что я в числе других лиц принадлежу
     к черносотенству".
Весной 1928г., после предупреждения об аресте, Олсуфьевы были вынуждены уехать — в городе уже было арестовано около 80 человек так называемых "церковников"